Údržba Vašeho GC. Chvostující píky.

Chvostující píky jsou nejčastější podobou nesymetrického signálu analytu. Jsou charakteristické asymetrií plochy píku před a za časem retenčního maxima.

V tomto případě je plocha píku analytu nacházející se za časem retenčního maxima větší než plocha píku analytu před časem retenčního maxima. Symetrii píku definuje faktor As, který je v případě chvostujících píků větší než 1.2. As je poměrem b ku a, kdy b je šířkou píku v 10 % jeho výšky za retenčním časem maxima a a je šířkou píku v 10 % jeho výšky před retenčním časem maxima.

Kdy dochází k tomuto jevu a co je jeho příčinou?

Odpovědí na tuto otázku může být více. Prvním místem, na které byste se na chromatografu měli zaměřit, je inlet a jeho pravidelná údržba. Nejběžnější příčiny chvostujících píku se totiž často skrývají právě zde.

Pakliže jsou píky zprvu symetrické a s každým dalším nástřikem vzorku se jejich tvar zhoršuje, jedná se o klasický příklad nástřiku znečištěného vzorku.

Při nástřiku jednoho či několika obzvláště špinavých vzorků se jev může vyskytnout i ve velmi krátkém čase v rozptylu několika analýz. Původcem jsou netěkavé látky hromadící se na koloně v průběhu měření, které následně mohou způsobit, jak posun retenčních časů, tak chvostování píků. Znečištění mohou působit i částečně těkavé látky, které v průběhu separace zkondenzují na koloně. Vzhledem k částečnému odparu a neustálému posunu systémem s každým dalším nástřikem mohou postupně pokrýt celou kolonu.

Stěžejním bodem prevence znečištění cesty vzorku je pravidelná údržba inletu a zkracování kolony. Většina nečistot se z povahy své netěkavosti hromadí hned zkraje kolony. Pravidelné seřezávání kolony o zhruba 20 cm jednoduše odstraní z cesty vzorku znečištěný úsek a často odstraní veškerý vliv nečistot na kvalitu výstupu chromatografu.

Řešením může být i proplach kolony rozpouštědlem, nicméně většina laboratoří si tuto údržbu nemůže dovolit vzhledem k vyšší časové náročnosti.

Nejúčinnější prevencí je pochopitelně vůbec nedopustit nástřik netěkavých nečistot do systému. Vhodně zvolená extrakce, či přečištění vzorku jsou prostředky, se kterými lze v tomto ohledu docílit znatelných výsledků. Pokud máte prostor, vybavení a zkušenosti pro optimalizaci přípravy vzorku před každým nástřikem (mikroextrakce na tuhé fázi, headspace nástřik, filtrace nečistot), určitě se tento krok projeví prodloužením životnosti vaší kolony. (Přehled kolon od Agilent Technologies)

Další variantou je začlenění tzv. retenčního gapu neboli předkolony mezi inlet a vlastní kolonu. Retenční gap je vlastně alternativou neustálého zkracování analytické kolony. Místo kroku seříznutí vlastní kolony, tak při zhoršení symetrie píků, nebo posunu retenčních časů, jednoduše vyměníte pouze retenční gap. Výhodou je, že s tímto řešením nezasáhnete do jednoho z klíčových parametrů separace, kterým je délka kolony. Při zkracování vlastní kolony tak neustále činíte a vystavujete se následně nutnosti přizpůsobení ostatních parametrů separace (teplota, průtok apod.).

Nečistoty lze zachytit i v prostoru inletu. Docílíte tak například s využitím lineru se skelnou vatou ve spodní části. Efekt skelné vaty lze vidět na obrázku. Nečistoty jsou zachyceny ve skelné vatě a nevstupují dále do systému. Bohužel tento prvek zachytí pouze netěkavé nečistoty, ty částečně těkavé prostupují vzhledem k neustálému částečnému odparu na kolonu. Odstranění částečně těkavých látek docílíme pouze vypálením kolon.

Vypálení kolony je vlastně jen pouhé zahřátí systému na 1-2 hodiny k teplotnímu limitu dané kolony. Takto by mělo dojít k uvolnění a průchodu většiny částečně těkavých látek ven ze systému.

Příčina znečištění se může dále nacházet kdekoliv v prostoru injektoru. Udává se, že tato část systému je příčinou zhoršení kvality výstupu až v 90 % případů. Pravidelná údržba nástřikových prostor by měla zahrnovat výměnu špinavého lineru, vyčištění všech ostatních prostor injektoru, výměnu zlatého těsnění i výměnu septa. (Podívejte se na videa věnující se správné instalaci kolon, výměně lineru, septa, splitovacího trapu a zlatého těsnění)

Pokud jste provedli vše zmíněné a stále pozorujete na výstupu z detektoru chvostující píky, může se jednat o důsledek pozměněné aktivity na koloně. K tomuto jevu dochází, pokud analyzujete látky, které chemicky interagují se stacionární fázi kolony. Pozměněné vlastnosti kolony na jejím začátku lze opět odstranit jejím zkrácením. Postup popisuje aplikační specialista Daron Decker v čase 2:45.

Předně přerušíte veškeré analýzy a počkáte, než prostředí pece a inletu zchladnou na běžnou teplotu. Následně uvolníte kolonu z inletu (pozor na neposedné ferulky) a pustíte se do toho. Kolonu uchopíte do jedné ruky a do druhé si vezmete keramický metr s řeznou hranou (cokoliv jiného s ostrou hranou). Keramický metr má dva okraje, hrubý a hladký. Hladkým okrajem lehce kolmo přejedete přes místo, ve kterém chcete kolonu zkrátit. Principem pohybu je narušit svrchní polyimidovou vrstvu, zajišťující ohebnost kolony, a vnitřního skleněného jádra se pouze dotknout. Kolonu byste neměli tímto pohybem ještě zcela zlomit. Následně jen lehce zatlačíte na oddělený konec a kolona by se měla ochotně zlomit. Tímto postupem se snažíte zajistit co nejsouměrnější zlom celým průměrem kolony. Hladký zlom je následně důležitý pro vstup vzorku na kolonu. Čistý řez tohoto konce zkracuje úsek kolony, čas, v němž je vzorek nanesen na kolonu, což přispívá rozlišení systému.

Pokud se aktivovaná pasáž kolony nachází ve vzdálenějších částech, její zkracování nepomáhá, bohužel se jedná o nevratné poškození stacionární fáze a řešením je pouze instalace nové kolony.

Při časté analýze aktivních látek je doporučováno používat ultra inertních kolon. Tyto kolony jsou tvořeny speciálně inertizovanými stacionárními fázemi a cíleny právě pro analýzy chemicky aktivních analytů. Stárnutím mohou i tyto podlehnout chemickému působení některých agresivních analytů, ale jejich odolnost je větší a životnost delší.

Některé agresivní, velmi reaktivní analyty budou vždy vytvářet chvostující píky a tuto asymetrii nikdy zcela neodstraníte ani s použitím ultra inertních kolon.

K optimalizaci může občas ještě přispět pasivace kolony. Jedná se o několikanásobné promytí kolony vysokými koncentracemi aktivního analytu, který pokryje většinu reaktivních míst stacionární fáze a během následné analýzy samotných vzorků je tak zajištěna její jednotná afinita. Pasivace je vždy pojena s konkrétním analytem. Její kladný efekt na symetrii píků bývá však často jen nepatrný.

Příčina chvostování píků může tkvět i v nerovnoměrnosti průchodu vzorku systémem. Jako příklady mohou sloužit nadměrný mrtvý objem systému, špatná instalace kolony, různé obstrukce toku nosného plynu, nebo třeba opět výrazná kontaminace kolony. Tyto příčiny pozměňují proudění vzorku systémem a prostorově narušují jeho rovnoměrnou separaci. Ověřit lze nástřikem analytu, o kterém víte, že je zcela inertní ke stacionární fázi kolony a převážně těkavý čili během separace stráví většinu času v mobilní fázi. Za normálních okolností tak vždy tvoří symetrické píky. Za tímto účelem se nejčastěji používají metan či butan. Pokud vám píky těchto plynů chvostují, pak víte, že máte v systému co do činění s obstrukci toku vzorku.

Jak již bylo zmíněno, důležitým předpokladem symetrických píků je správně nainstalovaná kolona. Chyby při instalaci mohou vést ke vzniku turbulentního proudění kolonou, nerovnoměrné separaci složek vzorku a obvykle deformaci tvaru píků v podobě chvostování. Při instalaci je tedy důležité seříznout kolonu čistým řezem, vsunout do inletu či detektoru vhodnou délku kolony a zajistit veškeré spoje proti netěsnostem. Vsunutím kolony příliš hluboko do prostoru inletu zbytečně rozšiřujeme mrtvý objem systému, vsunutím nedostatečně hluboko zase konec zůstane v kontaktu se zlatým těsněním, u jehož ústí se vyskytuje turbulentní proudění, jehož charakter se následně promítá i do průtoku vzorku kolonou a zabraňuje rovnoměrné separaci. Na straně inletu se doporučuje délka přesahu 4-6 mm nad ferulkou. Na detektorovém konci se vhodný přesah liší, ale obecně se doporučuje opatrně vsunout konec až kam prostor dovolí a následně pouze drobně povytáhnout zpět (pocitově, 1-2 mm).

Nepřehlédněte

Přehled kolon od Agilent Technologies zde.

Přehled videí věnující se údržbě Vašeho GC (instalace GC kolony, výměna lineru, septa, splitovacího trapu a zlatého těsnění) od Agilent Technologies naleznete v článku Agilent GC Troubleshooting

Nevíte si rady? Servisní oddělení HPST pravidelně organizuje hardwarová školení zaměřená na instrumentaci Agilent Technologies s důrazem na diagnostiku hardwarových problémů a údržbu systému.