Údržba Vašeho GC. Chvostující píky (2. část)

Turbulentní proudění průtoku vzorku kolonou můžeme nechtěně způsobit i nešikovným seříznutím kolony. Vliv na povahu proudění mají dále netěsnosti systému stejně jako obstrukce neboli překážky v proudění mobilní fáze. Příkladem obstrukci působících nečistot mohou být odštěpky septa, které se s rostoucím počtem nástřiků zákonitě dostávají do systému, nánosy netěkavých sloučenin ve skelné vatě lineru a podobně. Metaforicky lze nežádoucí jev turbulentního proudění přirovnat k vlivu kamene umístěného v rovnoměrném proudu vody horské říčky. Bezprostředně za kamenem vzniká turbulentní zpětný protiproud. Podobně bude pozměněn průtok nosného plynu a vzorku bezprostředně za jakoukoliv mechanickou nečistotou v GC koloně.

Někdy mohou být chvostující píky způsobeny nežádoucími polárními interakcemi mezi rozpouštědlem, rozpuštěnými látkami a stacionární fází kolony. Vždy pamatujte, že vodná rozpouštědla se nemísí s lipofilními látkami a naopak. Pokud je tedy pro vás problémem najít pro vzorek vhodné, v tomto směru optimální rozpouštědlo, pravděpodobně na následném chromatogramu uvidíte chvostující píky. Použité rozpouštědlo, vzorek i stacionární fáze kolony by si měly být látky blízké povahou své rozpustnosti ve vodě či v tucích. Chvostování píků bývá často projevem nesourodosti metody ve vlastnostech těchto látek. Optimalizovat shodu můžeme pochopitelně pouze změnou kolony a její stacionární fáze, nebo změnou rozpouštědla. Většina analytiků pak v tento moment raději strpí pokřivené píky, než aby zasahovali do parametrů metody.

V případě, že pozorujete chvostující nebo zkreslené píky pouze u látek s retenčními časy blízkými rozpouštědlu nebo píku hlavního analytu směsi, jedná se o reverzní efekt rozpouštědla. Látky eluující se v blízkosti rozpouštědla podléhají totiž při separaci nejen afinitě stacionární fáze, ale i afinitě rozpouštědla a jejich setrvávání na stacionární fázi tudíž není dostatečné pro optimální tvar a rozlišení píků. Tento jev si lze představit i jako jakousi soutěž mezi stacionární fázi a rozpouštědlem o vazbu s daným analytem. Ideální prevencí reverzního efektu rozpouštědla je použití 3 až 5 metrů dlouhé, deaktivované křemíkové předkolony.

Na videu můžete ve zkrácené délce vidět příklad takové předkolony. Její vliv na eliminaci reverzního efektu rozpouštědla můžete vidět na obrázku.

Pokud při splitless či on-column nástřiku pozorujete jev chvostujících píků snižující se se stoupajícím retenčním časem analytů, jedná se o přetrvávající reverzní efekt rozpouštědla. K nápravě tohoto jevu dopomůže snížení teploty kolony na počátku nástřiku, čímž zvýšíte fokusaci rozpouštědla. Obvykle se teplota v této souvislosti snižuje o 10 až 20 °C pod bod varu rozpouštědla. Na obrázku vidíte rozdíl v separaci a tvaru píků při fokusaci hexanu nastavením počáteční teploty kolony na 50 °C (teplota varu hexanu 68-69 °C).

Při počáteční teplotě kolony 70 °C je fokusační efekt zanedbatelný (vlevo), zatímco po snížení teploty na 50 °C dojde k znatelnému zúžení prostoru kondenzace rozpouštědla na počátku kolony – fokusaci, a tím i ke zlepšení tvaru píků ostatních analytů (vpravo).
Při splitovaném nástřiku se snažte docílit minimálního průtoku nosného plynu inletem 20 ml/min, lépe pak alespoň 30 ml/min. Nižší rychlosti proudu nosného plynu budou opět přispívat k chvostování píků, jak ukazuje následující obrázek
 

Povšimněte si chvostování prvních dvou píků. Splitovací poměr během tohoto nástřiku byl poměrně nízký (5:1) a průtok nosného plynu inletem následně již nebyl dostatečný, aby zajistil potřebně rychlý vstup většího objemu vzorku na kolonu. Zde byl průtok kolonou 1 ml/min. Při splitovacím poměru 5:1 se tak se započtením průtoku oplachu septa (3 ml/min) dostáváme na celkový průtok inletem pouhých 10 ml/min, což je příliš málo pro dostatečně rychlý proces vstupu vzorku na kolonu. Část těkavějších analytů tak již začíná procházet kolonou v momentě, kdy jejich úplný objem ještě zcela nestihl vstoupit na stacionární fázi kolony. Píky právě těchto složek následně na chromatogramu chvostují. Méně těkavé složky, později eluující analyty, které se kolonou pohybují pomaleji, tento jev nepostihne, protože mají vyšší bod varu a vstupují na kolonu jednotně i za vyšších počátečních teplot gradientu metody. Pomoci si v tomto případě můžete zvýšením splitovacího poměru a tím pádem zmenšením objemu vzorku vstupujícího na kolonu. Samozřejmě tak můžete učinit pouze pokud víte, že další zředění vzorku následně neohrozí citlivost detekce analytů nižších koncentrací. Efekt zvýšení splitovacího poměru ukazuje obrázek níže.

Příčiny chvostování píků a jejich řešení:

1. Znečištění prostoru inletu

• Proveďte základní údržbu inletu. Vyměňte liner, o-těsnění, septum, pokud je třeba, tak i zlaté těsnění.

2. Příliš špinavé vzorky

• Zvažte změnu přípravy vzorku, případně začleňte další kroky, například filtraci vzorku, aby se problém neobjevil znovu.

3. Zanesení počátku kolony netěkavými látkami, nečistotami

• Seřízněte kolonu. Zkrácení kolony většinou tento problém vyřeší.

4. Přítomnost mechanické překážky toku mobilní fáze

• Pakliže nic z předešlého nepomohlo, otestujte kolonu na přítomnost mechanické překážky průtoku nástřikem hexanu nebo butanu. Tyto látky by při plynulém průtoku neměly jevit jakékoliv deformace píků.

5. Špatně nainstalovaná kolona

• Uvolněte kolonu z inletu a detektoru a pečlivě ji opětovně připojte znovu zpět.

6. Nekompatibilní hydrofilita/lipofilita rozpouštědla, vzorku a stacionární fáze.

• Vyzkoušejte jiné rozpouštědlo, jiný typ kolony.

7. Chvostují píky vysoce těkavých analytů v blízkosti píku rozpouštědla

• nainstalujte 3 až 5 metrů dlouhou deaktivovanou křemíkovou předkolonu.

8. Při metodě využívající on-column či splitless nástřiku se jev chvostování objevuje u všech analytů a klesá se stoupajícím retenčním časem sloučeniny

• Uvažujte vliv přetrvávajícího reverzního efektu rozpouštědla. Snižte počáteční teplotu metody na 10 - 20 °C pod teplotu bodu varu rozpouštědla.

9. Problém se objevuje u těkavých, brzy eluujících analytů během splitovaného nástřiku

• Zkontrolujte, zda nemáte příliš malý splitovací poměr, tudíž na daný průtok inletem příliš velký objem vzorku vstupujícího na kolonu.

Článek Údržba Vašeho GC. Chvostující píky (1. část) k přečtení zde