16. 3. 2021
George Dierkes, Susanne Becher, Heike Schumacher, and Corinna Földi, German Federal Institute of Hydrology, Koblenz, Germany a kol.


Analýza mikroplastů ve vzorcích životního prostředí je v současné době velice aktuální téma poutající čím dál větší pozornost. V tomto aplikačním listu je představena metoda pro stanovení mikroplastů jako jsou polyethylen (PE), polypropylen (PP) a polystyren (PS). Metoda je založená na extrakci kapalinou za zvýšeného tlaku (PLE) s následnou pyrolýzou a analýzou pomocí plynové chromatografie ve spojení s hmotnostní spektrometrií. GC/MSD umožňuje stanovení mikroplastů ve vzorcích životního prostředí, a to na velmi nízkých koncentracích. Vlastní analýza byla provedena na sestavě Agilent 5977B GC/MSD, Agilent 7890 GC a naměřená data byla zpracována pomocí softwaru MassHunter. Pro reálné vzorky životního prostředí byla zhodnocena linearita, limity kvantifikace (LOQ) a reprodukovatelnost analytického měření. Velkým nedostatkem dřívějších GC/MSD metod byly obecně limity detekce. Představovaná metoda umožňuje kvantifikovat mikroplasty PE, PP a PS až na hladinách 0,005 mg/g. Z kalibračních vzorků byla dále získána velmi dobrá linearita měření (R2 >0,97), a to v rozsahu 0,005 až 1 mg/g vzorku. Pro vzorky uměle i přirozeně kontaminované byla stanovena relativní směrodatná odchylka (RSD) nižší než 10 %, což ukazuje velmi dobrou reprodukovatelnost a spolehlivost celé analýzy.

Úvod

Mikroplasty jsou běžně definovány jako plastové částice a fragmenty o velikosti menší než 5 mm. Tyto částice se dostávají do životního prostředí z mnoha různých zdrojů a přetrvávají v něm stovky a více let. Pravděpodobnost, že se dostanou do živých organismů a budou jimi kumulovány, je tak velmi vysoká. Toto nebezpečí je hlavním důvodem zvýšeného zájmu o metody, které umožňují jejich kvantifikace ve vzorcích životního prostředí jako je voda, půda a další organické matrice.

Vzhledem k vysoké molekulové hmotnosti a špatné rozpustnosti ve většině rozpouštědel je kvantifikace těchto látek ve vzorcích životního prostředí s použitím tradičních GC/MS a LC/MS/MS technik značně obtížná. Počet částic, identifikace, velikost a plošné rozložení mikroplastů mohou být stanoveny spektroskopickými technikami jako je například infračervená spektroskopie (IČ). Termální extrakce ve spojení s GC/MS pak komplementárně k těmto technikám poskytuje informaci o hmotnostní koncentraci mikroplastů, která může být nepostradatelným údajem pro regulační a monitoringové účely.1,2 Postupy využívající pyrolýzu ve spojení s plynovou chromatografií – hmotnostní spektrometrií (pyr-GC/MS) přinesly již dříve velmi slibné výsledky, nicméně tato technika již tradičně trpí nedostatečnými limity detekce, matričními efekty a nehomogenním rozložením částic mikroplastů ve vzorcích.

Dierkes a kolektiv doporučují pro spolehlivé stanovení plastů ve vzorcích životního prostředí využívat metod s limity kvantifikace nižšími než 1 mg/g.3 Vzhledem k výše uvedeným analytickým omezením vyvinuli pro kvantitativní stanovení mikroplastů na nízkých koncentracích v sedimentech, půdách a odpadních kalech robustní metodu založenou na extrakci kapalinou za zvýšeného tlaku (PLE) s pyr-GC/MS. Autoři navrhnuli metodu tak, aby umožňovala měření nejběžnějších mikroplastů jako jsou polyethylen (PE), polypropylene (PP) a polystyrene (PS) v relativně velkých objemech vzorků. V tomto aplikačním listu je popsaná metoda uplatněna s využitím sestavy Agilent 5977B GC/MSD, Agilent 7890 GC a softwarem MassHunter. GC/MSD stanovení bylo hodnoceno především z hlediska linearity, limitů kvantifikace (LOQ), reprodukovatelnosti a detekce a kvantifikace PE, PP a PS v reálných vzorcích životního prostředí. Kromě výše uvedených polymerů mohou být touto technikou dále stanoveny mikroplasty nylonu, polyuretanu (PUR), polyethylen tereftalátu (PET), ethylene-vinyl acetátu (EVA), polyvinyl chloridu (PVC), akrylonitril butadien styrenu (ABS) a mikroplasty polymerů obsahujících fluor.

Experimentální část

Příprava standardů a vzorků

Příprava kalibračních roztoků ze zásobního roztoku postupem ředění je vzhledem k nízké rozpustnosti PE a PP ve většině rozpouštědel prakticky nemožná. Přímé vážení velmi malých množství polymerů při přípravě kalibračních standardů nízkých koncentrací je zatíženo vysokým rizikem chyby, a též není vhodným postupem. Kalibrační roztoky byly z těchto důvodů připraveny metodou postupného ředění zásobní směsi s inertní matricí (kalcinovaný mořský písek). PE, PS (PSS polymer) a PP (Sigma-Aldrich) byly nejprve rozemlety v kryomlýnku a 250 mg od každého bylo následně smícháno s kalcinovaným mořským pískem, tak aby bylo získáno 10 g zásobní směsi. Takto získaná směs byla dále 20 min homogenizována v planetovém mlýnku. Zásobní směs byla dále ředěna, tj. 1 až 2 g byly smíchány s pískem tak, aby bylo dosaženo výsledné koncentrace polymeru pro každý kalibrační bod od 0,005 do 10 mg/g. Směs byla homogenizována po každém ředícím kroku.

Příprava vzorku probíhala následovně. 1 g vzorku byl umístěn do 10ml ocelové extrakční cely a byl extrahován v zařízení pro extrakci kapalinou za zvýšeného tlaku (PLE). Pro snížení matričních efektů byla začleněna před-extrakce methanolem. Vlastní extrakce mikroplastů probíhala při 185 °C a 100 bar pomocí tetrahydrofuranu. Extrakt byl sbírán do 60 ml viálek s 200 mg kalcinovaného silikagelu. Do každého vzorku bylo následně přidáno 10 µl polystyrenu-d5 (270 µg/ml dichlormethanu, Polymer Source), který slouží jako vnitřní standard. Rozpouštědlo bylo následně odpařeno a srážející se mikroplasty byly zachyceny na silikagelu. Mikroplasty ulpívající na stěnách viálky byly nejméně třikrát vypláchnuty dichlormethanem. Silikagel byl následně homogenizován po dobu 5 min.

Více detailů týkajících se přípravy standardů a vzorků najdete v článku Dierkes a kol.3

Kalibrační vzorky, vzorky pro validaci metody (kromě vzorků pro testování velikosti částic), blanky (obsahující pouze písek) a reálné vzorky životního prostředí byly extrahovány stejným postupem.

Pyr-GC/MS analýza a instrumentální vybavení

Pyr-GC/MS analýza všech vzorků proběhla pomocí Multi-Shot Pyrolyzéru EGA/PY-3030D a Auto-Shot Sampleru AS-1020E (Frontier Laboratories) ve spojení s plynovým chromatografem 7890B a 5977B GC/MSD. Pro každou analýzu bylo použito 20 mg zhomogenizovaného silikagelu, který byl navážen do 80-µl pyrolyzního kelímku (Eco-Cup LF, Frontier Laboratories) a pyrolyzován při 600°C.

Plynový chromatograf 7890B byl vybaven kolonou HP-5ms UI se stacionární fází (5%-fenyl)-methylpolysiloxan (30 m × 0.25 mm × 0.25 µm, 19091S-433UI). Inertní provedení propojení plynového chromatografu a hmotnostního spektrometru Agilent zajišťuje vysokou výkonnost celé analýzy, a to především s ohledem na analyty nízkých koncentrací. Inertní povrch umožňuje rozšíření rozsahu jejich detekce a kvantifikace. Hmotnostní detektor 5977B GC/MSD byl dále vybaven extrakčním EI zdrojem a pro maximální citlivost byl zvolen a použit mód monitoringu vybraných iontů (SIM). Extrakční EI zdroj maximalizuje počet iontů, které jsou vytvořeny a následně z těla zdroje přeneseny do kvadrupólového analyzátoru a dále do detektoru. Celková doba GC/MS analýzy byla 29 min. Konfigurace GC/MS systému a podmínky vlastního měření jsou shrnuty v Tabulce 1 a 2.

Tabulka 1. Parametry plynového chromatografu Agilent 7890B.

Tabulka 1. Parametry plynového chromatografu Agilent 7890B.

Tabulka 2. Parametry hmotnostního detektoru Agilent 5977B GC/MSD.

Tabulka 2. Parametry hmotnostního detektoru Agilent 5977B GC/MSD.

Akviziční a kvantifikační metoda

Akvizice a zpracování dat bylo provedeno v softwaru MassHunter verze B.07.00. Pro produkty pyrolýzy každého polymeru byly měřeny vybrané ionty v módu SIM. Tyto jsou spolu s retenčními časy produktů pyrolýzy jednotlivých polymerů uvedeny v Tabulce 3. Sledované ionty byly následně použity pro kvantifikaci jednotlivých polymerů.

Kvantifikace byla provedena na základě kalibračních křivek 1/x sestrojených v softwaru MassHunter Quantitative.

Tabulka 3. Sledované ionty, retenční časy a sledované produkty pyrolýzy pro jednotlivé polymery.

Tabulka 3. Sledované ionty, retenční časy a sledované produkty pyrolýzy pro jednotlivé polymery.

Zhodnocení a validace metody

Selektivita metody byla ověřena na základě extrakce a proměření matrice prosté mikroplastů, která byla smíchána s mořským pískem (3 hm. %). Testované matrice zahrnovaly třešňové dřevo, pupalkové listy, tisové jehličí, huminové kyseliny, filet z kapra, raka, motorový olej a filtrační papír. Tyto matrice obsahují proteiny, tuky a polysacharidy a jsou svým složením tudíž typické pro vzorky environmentálního původu.

Výtěžnost metody byla zjištěna na základě analýzy 1 g písku, který obsahoval 3 hm.% huminových kyselin uměle kontaminovaných 0,05 a 0.75 mg PE, PP a PS. Reprodukovatelnost metody byla ověřena opakovanou analýzou pěti vzorků životního prostředí, z nichž každý byl analyzován vícekrát.

Vliv velikosti částic mikroplastů na reprodukovatelnost měření a minimální množství vzorku nutné pro získání reprezentativního alikvótu byly ověřeny analýzou směsi písku a PE dvou různých velikostí (10 až 50 µm a 200 až 400 µm), který byl kontaminována na dvou koncentračních hladinách (1 mg/g a 10 mg/g).

Zda je metoda vhodná pro testování reálných vzorků životního prostředí bylo ověřeno analýzou různých matric zahrnujících sedimenty, suspendovanou říční hmotu, substrát a odpadní kaly, které byly odebrány, usušeny a následně připraveny pro vlastní extrakci a analýzu. Od každé matrice bylo odebráno alespoň 500 g a byla analyzována alespoň ve třech opakováních postupem popsaným výše. Kontaminace vzorků z plastových nástrojů a nádobí byla pečlivě kontrolována.

Výsledky a diskuze

Linearita a limity kvantifikace

Chromatogram standardní směsi o koncentraci 0,25 mg/g je ukázán na Obrázku 1.

Pro vykreslení kalibračních křivek byly spočítány relativní plochy píků s využitím vnitřního standardu polystyrenu-d5. Lineární kalibrační křivky (R>0,97) až do 0,005 mg/g byly získány pro všechny polymery. Lineární odezva do 1 mg/g byla získána pro PP a PS. Pro PE byla odezva lineární až do 10 mg/g.

Velkým problémem v podobě rizika falešně pozitivní detekce při stanovení mikroplastů bývá hojný výskyt plastového spotřebního materiálu a plastových pomůcek ve většině laboratoří. Z tohoto důvodu autoři definovali LOQ jako koncentrace, na kterých bude mít 95 % slepých vzorků nižší odezvu než je dané LOQ. LOQ jako koncentrace polymerů ve slepých pokusech s jednostranným intervalem spolehlivosti (t(ρ = 0.95; n-1 = 10) = 1,812) byly vypočteny na základě průměrné relativní odezvy 11 slepých vzorků (viz Tabulka 4).

Tabulka 4. Limity kvantifikace.

Tabulka 4. Limity kvantifikace.

Obrázek 1. Extrahované iontové chromatogramy standardní směsi na hladině 0,25 mg/g.

Obrázek 1. Extrahované iontové chromatogramy standardní směsi na hladině 0,25 mg/g.

Selektivita metody

V dalším kroku byly stanoveny možné interference pocházející z matric nekontaminovaných vzorků životního prostředí, a to vzhledem k tomu, že kvantifikační metoda pro pyr-GC/MS stanovení je založena na nepřímé kvantifikaci produktů pyrolýzy jednotlivých polymerů (Tabulka 3). V testovaných matricích nebyly zjištěny žádné interference pro PP. Dřevo jako matrice, mělo za následek navýšení hodnoty pozadí pro PS, a to o 0,042 mg/g. Naopak rybí matrice bohatá na proteiny a v nich obsaženou aminokyselinu fenylalanin, která je při pyrolýze prekurzorem styrenu, ke vzniku interferencí nepřispěla. Proteiny byly totiž odstraněny během před-extrakce methanolem. Z výše uvedeného vyplývá, že kvantifikace PP a PS ve vzorcích životního prostředí založená na pyr-GC/MS by neměla být výrazněji ovlivněna přítomností přirozeně se vyskytujících látek. Výjimku představují matrice s vysokým podílem dřeva. Naproti tomu kvantifikace PE interferencemi ovlivněna byla. Z 30 mg motorového oleje vznikly ionty, které intenzitou své odezvy přibližně odpovídaly standardu o koncentraci 1,1 mg PE. Tento výsledek poukazuje na problém, který může vzniknout při měření vzorků kontaminovaných olejem nebo benzínem. Souhrnem lze ale říci, že kroky před-extrakce methanolem a vlastní extrakce THF spolu s volbou indikátorových iontů pro kvantifikaci dohromady tvoří vysoce specifický analytický postup, vhodný pro kvantifikaci mikroplastů ve vzorcích s vysokým podílem organické hmoty.

Výtěžnost a reprodukovatelnost metody

V tabulce 5 jsou ukázány výtěžnosti PP, PS a PE v huminových kyselinách a mořském písku. Pokud uvažujeme statistickou odchylku ±20 %, matriční efekty nepředstavují žádné problémy. Výtěžnosti v ostatních organických vzorcích jako jsou rybí filet, rak, listy a jehličí, byly obdobné. Relativní směrodatné odchylky (RSD) byly 10 % a nižší, což ukazuje na výbornou reprodukovatelnost a spolehlivost metody.

Tabulka 5. Výtěžnosti pro jednotlivé polymery a hladiny umělé kontaminace.

Tabulka 5. Výtěžnosti pro jednotlivé polymery a hladiny umělé kontaminace.

Vzhledem k tomu, že přímá (tj. bez extrakce) analýza pyr-GC/MS 20 mg vzorku, což je maximální množství, které lze umístit do 80 µL pyrolyzního kelímku, vedla k vysokým hodnotám RSD, a to až 50 %, bylo zvýšeno množství vzorku pro PLE s tetrahydrofuranem, a to až na 1000 mg. Při použití 200 mg frakce 10 až 50 µm byly RSD do 10 %, zatímco pro frakce 200 až 400 µm i při použití většího množství 1000 mg bylo RSD 21 %. Tyto výsledky ukazují, že vzorky s obsahem částic mikroplastů větších než 200 µm by měly být před vlastní extrakci PLE rozemlety v kryomlýnku, aby bylo dosaženo homogenního rozložení částic.

Analýza vzorků životního prostředí

Kontaminace PP, PE a PS byla zjišťována ve vzorcích sedimentů, suspendovaných částic a odpadních kalů. Výsledky těchto analýz jsou uvedeny v Tabulce 6. Bylo zjištěno následující:

  • Ve vzorcích říčních sedimentů byly detekovány PP a PE na hladinách 0,032 ± 0,001 a 0,028 ± 0,006 mg/g, respektive, zatímco PS nepřekročil hladinu LOQ (0,008 mg/g). PE a PP byly detekovány v suspendované hmotě na hladinách 0,98 ± 0,02 a 0,055 ± 0,010 mg/g, respektive.
  • V odpadních kalech byly všechny tři polymery detekovány na koncentracích v rozmezí od 0,08 ± 0,02 mg/g (PP) do 3,3 ± 0,3 mg/g (PE).
  • Substrát obsahoval PE na koncentračních hladinách podobných jako v odpadních kalech, u PP byla zjištěna pouze stopová množství a PS nebyl detekován.
  • V půdě vzorkované v okolí silnic byly všechny tři polymery zjištěny na hladinách dosahujících až 0,85 ± 0,07 mg/g (PE).

Tyto výsledky potvrzují, že GC/MSD 5977B je vhodný pro detekci a kvantifikaci mikroplastů PE, PP a PS technikou pyr-GC/MS z různých typů matric.

Tabulka 6. Výsledky analýzy vzorků životního prostředí.

Tabulka 6. Výsledky analýzy vzorků životního prostředí.

Závěr

Předložený aplikační list dokazuje, že Agilent 5977B GC/MSD ve spojení s Agilent 7890 GC a softwarem MassHunter představuje efektivní řešení pro rutinní, robustní a spolehlivou kvantifikaci mikroplastů ve vzorcích životního prostředí s využitím metody pyr-GC/MS popsané v publikaci Dierkes a spol.3 Využitím techniky GC/MSD byl především adresován nedostatek ostatních uplatňovaných analytických metod, jímž jsou nedostatečné limity detekce. Mikroplasty PE, PP a PS byly úspěšně kvantifikovány na nízkých koncentracích (až do 0,005 mg/g) v testovaných matricích i v reálných vzorcích životního prostředí. Pro všechny tři analyty bylo dosaženo výborné linearity (R2>0,97) pro kalibrační vzorky od 0,005 do 1 mg/g. Pro PE byla odezva lineární až do 10 mg/g. Relativní směrodatná odchylka (RSD) do 10 % byla dosažena jak pro uměle kontaminované, tak pro reálné vzorky, což představuje excelentní reprodukovatelnost a spolehlivost celé metody.

Zdroj

Převzato z originálu Quantification of Microplastics in Environmental Samples Using Pyrolysis and GC/MSD (Application Note, 5994-2199EN, Agilent Technologies, 2020). Přeložila Kamila Hanišová. 

Autoři

  • George Dierkes, Susanne Becher, Heike Schumacher a Corinna Földi (German Federal Institute of Hydrology, Koblenz, Germany)
  • Tim Lauschke a Thomas Ternes (Institute of Integrated Natural Sciences, University Koblenz-Landau, Germany)
  • Joerg Riener (Agilent Technologies, Inc.)

Literatura

  1. Robey, D. Microplastics Analysis Doesn’t Need to Be So Hard. Agilent Technologies, publication number 5994-1584EN, 2019.
  2. Scircle, A. et al. Occurence of Microplastic Pollution at Oyster Reefs and Other Coastal Sites in the Mississippi Sound, USA: Impacts of Freshwater Inflows from Flooding. Toxics 2020, 8(2), 35. https://doi.org/10.3390/toxics8020035.
  3. Dierkes, G. et al. Quantification of microplastics in environmental samples via pressurized liquid extraction and pyrolysis-gas chromatography. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2019, 411, 6959-6968. https://doi,org/10.1007/s00216-019-0206609

Servis

Servisní
požadavek

Přejít na formulář

Rychlé odkazy

Servis
Servisní tým
 

HPST webináře
Záznamy webinářů
 

Zůstaňte s námi v kontaktu

Odběr newsletteru

Přihlásit se k odběru